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Tecniche di prelievo per campioni Citopatologici

di DVM Francesco Albanese*


Nella pratica clinica dermatologica sempre più si ricorre all’ esame citopatologico. Con questa breve presentazione descriverò le corrette tecniche di campionamento da lesioni cutanee.
La lettura di un campione citopatologico rappresenta l’ultimo di una serie di steps che includono: la scelta della lesione, il metodo di campionamento e il corretto allestimento del vetrino. Ogni errore commesso in uno qualsiasi di questi passaggi può inficiarne l’interpretazione.
Tecniche di campionamento e preparazione del vetrino
Le tecniche di prelievo per i campioni provenienti da lesioni cutanee si differiscono in base al tipo di lesione. Le principali metodiche di cui ci si avvale comprendono:
a) l’apposizione, b) il raschiato e c) la biopsia ad ago sottile, con o senza aspirazione.

a) Apposizione
La tecnica di apposizione è impiegata per campionare cellule da lesioni superficiali quali lesioni essudative, papule e pustole. In caso di lesioni essudative o ricoperte da materiale grasso, è sufficiente apporre delicatamente il vetrino sulla lesione affinché le cellule aderiscano alla sua superficie. Anche per quelle papulari è sufficiente appoggiare il vetrino sulla loro sommità, ma dopo aver spremuto gentilmente la papula tra le dita.
Per campionare cellule da pustole intatte viene solitamente utilizzata la tecnica definita “calco di Tzanck”. Questa procedura consiste nel raccogliere il pus mediante apposizione di un vetrino sull’essudato esposto dopo la rottura della pustola effettuata alla sua base e dopo aver sollevato i cheratinociti che ne costituiscono il “tetto” (Figura 1).
Una volta rotta la pustola come descritto, il pus può anche essere raccolto utilizzando il margine corto del vetrino e poi strisciato su un secondo vetrino.
Le pustole si disidratano rapidamente, si rompono ed esitano nella formazione dei cosiddetti “collaretti epidermici”, caratteristiche lesioni circolari con un’area centrale alopecica e talvolta iperpigmentata, delimitate da detrito crostoso. In presenza di collaretti è necessario sollevare le croste ai bordi della lesione per trovare essudato fresco da campionare.
La tecnica per impronta è inoltre utilizzata per prelevare cellule dalla superficie inferiore delle croste. La procedura è molto semplice: una volta che la crosta viene rimossa, è sufficiente appoggiare la sua superficie inferiore su un vetrino o è possibile apporre quest’ultimo direttamente sulla cute esposta dopo la rimozione della crosta. Nel caso di lesioni essudative rilevate (es. placche), l’apposizione potrebbe condurre a un’errata interpretazione se prelevassimo cellule solo con questa metodica, poiché tutte le lesioni cutanee sono esposte alla contaminazione batterica orale e ambientale; pertanto quando dobbiamo prelevare cellule da placche e noduli erosi o ulcerati, la biopsia con ago sottile resta comunque la tecnica d’elezione.
Nelle lesioni desquamative “secche”, in cui l’apposizione del vetrino non permetterebbe alle cellule di aderire, possiamo raccogliere materiale usando del nastro adesivo trasparente. Questa tecnica, cosiddetta “scotch® test”, è anche il miglior metodo per prelevare cellule da lesioni interdigitali o da pieghe cutanee, sulle quali non è possibile posizionare direttamente il vetrino.
Essa consiste nel far aderire il lato adesivo di un pezzo di scotch sopra la lesione; le cellule presenti sulla cute rimangono così attaccate al collante (Figura 2).

Fig. 1: calco di Tzanck: Rottura della base della pustola con un ago

Fig. 1: calco di Tzanck:
Rottura della base della pustola con un ago

 Fig. 2: Scotch® test su una lesione interdigitale

Fig. 2: Scotch® test su una lesione interdigitale

b) Raschiato
Il raschiato superficiale è una tecnica traumatica utilizzata per prelevare una grande quantità di cellule da lesioni ulcerate. Il numero di cellule raccolte è maggiore rispetto a quello ottenuto mediante apposizione, anche se i campioni potrebbero essere maggiormente danneggiati ed emocontaminati. Il metodo può essere eseguito servendosi di una lama da bisturi o del lato corto di un vetrino portaoggetto. Il materiale presente sulla superficie della lesione è solitamente ricco di detrito necrotico, fibrina, sangue e di conseguenza raramente diagnostico; è pertanto consigliabile rimuovere detto materiale e di campionare quello subito al di sotto mediante una seconda delicatissima scarificazione. Il materiale raccolto viene poi delicatamente strisciato su un secondo vetrino stando attenti a non applicare un’eccessiva pressione che possa danneggiare le cellule. La tecnica di scarificazione può essere inoltre impiegata per campionare cellule direttamente da una cute grassa o da pieghe ungueali.

c) biopsia ad ago sottile (FNB)/ biopsia per ago-aspirazione (FNAB).
L’ago infissione, con o senza aspirazione, è la tecnica più utilizzata in citologia veterinaria, perché i noduli sono lesioni cutanee molto frequenti e quelli da cui si ottengono il maggior numero di campioni diagnostici.
FNB non richiede manovre di aspirazione forzata come FNAB; ciò è molto utile quando le lesioni sono localizzate in aree particolarmente delicate, dolorose o pericolose, come palpebre e giunzioni muco-cutanee. Nei campioni che cedono uno scarso numero di cellule con FNB, è possibile eseguire un prelievo mediante FNAB al fine di ottenere un prelievo più cellulare.
Per eseguire un FNB, è semplicemente necessario inserire l’ago nel nodulo e muoverlo avanti e indietro oltre a ruotarlo in più punti all’interno della lesione. Questi movimenti permettono alle cellule di penetrare all’interno dell’ago. FNB riduce il “trauma” cellulare e, nella maggior parte dei casi, ci permette di prelevare campioni sufficientemente cellulari (Figure 3,4).
Il materiale raccolto non deve essere “spruzzato” sul vetrino con troppa energia, ma delicatamente depositato su di esso per essere poi strisciato utilizzando un secondo vetrino che si fa scorrere sul primo in direzione opposta.
La pressione da esercitare sui vetrini dipende dalla consistenza del materiale raccolto e solo l’esperienza permetterà di acquisire le manualità appropriate al fine di ottenere campioni di ottima qualità, che preservino al meglio cellule e le dispongano in un monostrato, fondamentale ai fini di un’ottimale colorazione. Nel caso in cui venga prelevato molto materiale, si raccomanda di utilizzarlo per allestire più vetrini, alcuni dei quali possono essere utilizzati per eventuali colorazioni speciali.

Fig. 3: FNB: ago inserito in un piccolo nodulo vulvare

Fig. 3: FNB: ago inserito in un piccolo nodulo vulvare

Fig. 4: FNAB: prelievo di cellule mediante aspirazione forzata

Fig. 4: FNAB: prelievo di cellule mediante aspirazione forzata

Colorazione del vetrino
La colorazione più comunemente utilizzata nella pratica ambulatoriale è quella tipo Romanowsky, di norma impiegata per colorare gli strisci di sangue (Hemacolor®, Diff Quick®). E’ una colorazione pancromatica che permette di ottenere degli ottimi dettagli citoplasmatici e di visualizzare la maggior parte dei microrganismi, anche se alcuni dettagli, nucleari potrebbero andare persi. Come già accennato in precedenza, per avvalersi di queste colorazioni, dobbiamo allestire vetrini con cellule disposte in monostrato cosicché il colorante le possa completamente permeare. Queste colorazioni hanno il grande vantaggio di essere veloci da usare: solo pochi secondi.
I kit in commercio di colorazioni rapide sono costituiti da tre soluzioni: un fissativo su base alcolica, un primo colorante con affinità per substrati acidofili (rosso) e un secondo per quelli basofili (blu). La colorazione si esegue mediante immersione ed estrazione in rapida sequenza e per pochi secondi, del vetrino nelle tre soluzioni. Non vi è un numero stabilito di immersioni da effettuare, ma se ne raccomandano almeno tre o quattro per ogni colorante.
Il materiale ottenuto mediante “scotch® test” può essere colorato in diversi modi. Se lo scotch è di buona qualità, può essere colorato come un vetrino, ma la maggior parte degli scotch hanno la tendenza, una volta immersi nel fissativo, ad arricciarsi o opacizzarsi. Per ovviare a ciò si può immergere il nastro direttamente nei coloranti, senza fissare le cellule nella soluzione alcolica. Una variante più rapida, la preferita dall’autore, prevede che lo scotch, con la parte adesiva su cui sono adese le cellule, sia direttamente collocato su un vetrino portaoggetto su cui sono state precedentemente poste alcune gocce del colorante blu o, preferibilmente, di blu di lattofenolo o cristalvioletto. Questa variante è molto rapida ma, prima di osservare il vetrino al microscopio, bisogna rimuovere la grande quantità di colorante usato che renderebbe impossibile la lettura del campione; per questo scopo si comprime delicatamente un pezzo di carta assorbente sulla superficie dello scotch.
*Consulente Dermatologia – Tesoriere Sidev
Consulente Laboratorio di Analisi La Vallonea




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